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2025年4月22日，國際頂級學(xué)術(shù)期刊Nature以“加速預(yù)覽（Accelerated Article Preview）”的形式在線發(fā)表了中國科學(xué)院武漢病毒研究所張磊砢研究員與上海科技大學(xué)、中國科學(xué)院上海藥物研究所、清華大學(xué)和重慶醫(yī)科大學(xué)等多家單位合作的題為“Substrate recognition and cleavage mechanism of the monkeypox protease ，Core protease”的最新研究成果。該工作在國際上首次闡明了猴痘病毒核心蛋白酶（Core protease ，CorePro）三維結(jié)構(gòu)，揭示了核心蛋白酶底物識別與催化的分子機制，通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計策略發(fā)現(xiàn)了具有高效酶抑制活性和廣譜抗正痘病毒活性（猴痘病毒、痘苗病毒）的先導(dǎo)化合物，并闡明其微觀作用機制。該系統(tǒng)性工作證實了正痘病毒的核心蛋白酶是一個全新的廣譜抗病毒藥物靶標(biāo)，為靶向核心蛋白酶開發(fā)廣譜高效抗正痘病毒藥物提供了堅實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和良好的先導(dǎo)化合物。
猴痘病毒屬于正痘病毒屬（orthopoxvirus genus），該屬還包含3種已知的人畜共患病毒，分別是天花病毒（VARV）、痘苗病毒（VACV）和牛痘病毒（CPXV）。歷史上，人類與天花病毒斗爭了近千年，曾有數(shù)億人因天花病毒感染死亡。自1970年剛果民主共和國報道首例猴痘病例以來，猴痘病毒主要流行于非洲中部和西部，在非洲以外地區(qū)很少發(fā)現(xiàn)。2022年5月，猴痘病毒擴散傳播至英國，并迅速席卷全球，截至2025年2月28日，全球131個國家和地區(qū)共報道了13.4萬例猴痘病例，死亡291例。猴痘疫情分別于2022年7月23日和2024年8月15日兩次被WHO宣布為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件（PHEIC）。目前尚無具有明確療效的抗猴痘病毒藥物，因此發(fā)現(xiàn)和確證抗猴痘病毒新靶標(biāo)，開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、低毒高效且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗猴痘病毒藥物具有重大意義，既可用于應(yīng)對當(dāng)前猴痘疫情，又可作為國家儲備藥以應(yīng)對未來正痘病毒暴發(fā)危機。
正痘病毒是一類包膜的雙鏈DNA病毒，復(fù)制過程中會編碼一種高度保守的核心蛋白酶（在痘苗病毒和猴痘病毒中稱為I7L，在天花病毒中稱為K7L），核心蛋白酶通過水解核心蛋白前體驅(qū)動感染性成熟顆粒（IMV）的形成，在正痘病毒生命周期中發(fā)揮了重要作用，因此闡明其三維結(jié)構(gòu)和底物識別機制，并基于此開展先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)研究具有重要意義。
研究團隊成功解析了猴痘病毒核心蛋白酶的高分辨率三維結(jié)構(gòu)（圖1）。核心蛋白酶為二聚體，每個單體可分為N端結(jié)構(gòu)域NTD、催化結(jié)構(gòu)域CD和C端結(jié)構(gòu)域CTD。活性中心位于催化結(jié)構(gòu)域，包含一個特征的催化三聯(lián)體Cys328-His241-Asp258。研究團隊通過高通量篩選策略發(fā)現(xiàn)泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64d具有潛在的核心蛋白酶抑制效果和抗猴痘病毒活性，但活性較弱。猴痘病毒核心蛋白酶與E64d的復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)其與活性中心附近一個非催化Cys237殘基發(fā)生共價結(jié)合，未能完全占據(jù)底物結(jié)合口袋。
圖1?猴痘病毒核心蛋白酶的整體結(jié)構(gòu)、催化結(jié)構(gòu)域特征及二聚化模式
為了開發(fā)更強效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制劑，研究團隊開展了猴痘病毒核心蛋白酶底物識別和催化機制的研究。基于核心蛋白酶天然底物P25K序列，利用醛基替換切割斷裂的酰胺鍵設(shè)計了底物類似物I-G18，期望能夠與催化中心Cys328共價結(jié)合，模擬催化中間體的結(jié)構(gòu)特征。研究團隊通過冷凍電鏡技術(shù)，成功解析了CorePro-I-G18復(fù)合物結(jié)構(gòu)（圖2）。與apo結(jié)構(gòu)相比，在底物的誘導(dǎo)下，核心蛋白酶活性中心會發(fā)生一系列構(gòu)象變化，暴露出催化活性中心，完成底物的水解。S1和S2口袋形成了特征性的狹長空腔，僅可容納Gly（P1位）和Ala（P2位）等側(cè)鏈尺寸較小的氨基酸殘基，合理解釋了正痘病毒核心蛋白酶Ala-Gly序列識別專一性。
圖2?猴痘病毒核心蛋白酶的底物識別機制
以核心蛋白酶的底物識別機制為基礎(chǔ)，研究團隊利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計策略設(shè)計合成了擬肽類抑制劑A1~A6，引入P1~P5片段分別占據(jù)核心蛋白酶S1~S5底物結(jié)合口袋，同時在P1位置連接親電彈頭warhead與催化中心Cys328殘基共價結(jié)合（圖3）。活性測試發(fā)現(xiàn)A2~A6具有高效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性（IC50為44.9～100.3 nM），其中化合物A3活性最優(yōu)，IC50達到44.9 nM，較底物衍生的九肽醛I-G18提高7倍（I-G18的IC50為314 nM）。為了闡明酶抑制活性的差異，研究團隊解析了A1、A3和A4與核心蛋白酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示三個化合物均可與催化中心的Cys328殘基共價結(jié)合，同時能夠較好地占據(jù)底物結(jié)合口袋，其中A3的P4片段F原子能夠與Asp194殘基形成額外氫鍵相互作用，合理揭示了A3酶抑制活性更優(yōu)的原因。抗病毒活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物A3~A6具有較強的抗猴痘病毒活性（EC50為1.98～7.31 μM）和抗痘苗病毒活性（EC50為1.39～3.66 μM），具有廣譜性；同時表現(xiàn)出良好的安全性，CC50均大于200 μM。相較于九肽醛I-G18，擬肽類化合物的抗病毒活性顯著提高（I-G18在50 μM濃度下未顯示出抗病毒活性）。研究結(jié)果表明，A3~A6是良好的先導(dǎo)化合物，有望通過進一步成藥性結(jié)構(gòu)優(yōu)化開發(fā)出廣譜抗正痘病毒藥物。
圖3?核心蛋白酶抑制劑的設(shè)計發(fā)現(xiàn)與作用模式研究
（a猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性；b抗痘苗病毒活性；c抗猴痘病毒活性）
武漢病毒所肖庚富學(xué)科組博士后曹浚垣為共同第一作者之一，實驗師尚衛(wèi)娟、助理研究員張宇旻參與研究工作。該研究工作獲得了教育部學(xué)科突破先導(dǎo)項目、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、上海市重大傳染病和生物安全研究院、上海尚思自然科學(xué)研究院等項目的資助。上海科技大學(xué)生物電鏡平臺、上海同步輻射光源、國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施等平臺為本工作提供了技術(shù)支持。
全文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-09014-x